1. Th2 型细胞因子直接激活感觉神经元
RT-PCR 结果显示小鼠和人类的背根神经节(DRG) 和三叉神经节 (TG) 表达 IL-4Rα (Il4ra) 和 IL-13Rα1 (Il13ra1),但不表达 IL-5Rα (Il5ra) 的。钙成像结果表明,IL-4 或 IL-13 分别诱导 4.1%和 3.3%的 DRG 神经元的胞内钙升高,且感觉神经元对 IL-4或 IL-13 的反应频率以剂量依赖性方式增加。由于缺乏 Il5ra 的表达,IL-5 不引发 DRG 神经元的钙反应。此外,IL-4 也能诱导人类感觉神经元的胞内钙升高。综之,这些发现表明在小鼠和人类中感觉神经元对 Th2 型细胞因子(如 IL-4)的反应是保守的。
2. Th2 型细胞因子激活痒觉感觉通路
通过重新分析已发表的两个神经元转录组数据库,本研究发现,Il4ra 的表达在非肽能和肽能痒觉和伤害性感觉神经元中较丰富。使用单细胞 RNA-seq 数据库发现,与其他伤害性感觉神经元 (PEP1和 PEP2) 和机械感受神经元 (TH) 相比,Il4ra 和Il13ra1 的表达在痒觉神经元(NP1,NP2 和 NP3)中较丰富。钙成像结果发现,主要是小直径的神经元对 IL-4 和 IL-13 有反应。89% 对 IL-4 反应的神经元对 IL-31、组胺或两者有反应。75% 对 IL-13 反应的神经元对 IL-31、组胺或两者有反应。63%对 IL-4反应的神经元也对 IL-13 有反应。45%对 IL-4 反应的神经元也对胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP) 有反应。先前研究表明,组胺和 MrgprA3 激动剂氯喹分别激活瞬时感受器电位通道 (TRP) TRPV1 和TRPA1,诱导胞外钙内流。IL-4 或 IL-13 诱导 DRG神经元的胞内钙升高完全依赖于 TRPV1 的表达和细胞外钙。预处理 DRG 神经元 IL-4 之后,可增强DRG神经元对组胺、氯喹、TSLP和IL-31的钙反应。行为学结果发现,皮内注射高剂量的 IL-4 或 IL-13并不引起急性抓挠行为,但皮内注射 IL-4 可增强组胺诱导的抓挠行为。因此,尽管 Th2 型细胞因子本身不是有效的急性致痒剂,但是它们能使感觉神经元对多种不同的致痒剂敏感化。
3. 感觉神经元 IL-4Rα 信号介导慢性痒
为探讨感觉神经元特异的 Th2 型细胞因子信号转导在慢性痒中的作用,本研究构建了在感觉神经元上特异性敲除 IL-4Rα 的小鼠 (Na V 1.8-Cre +IL-4Ra fl/fl ,IL-4Rα Δneuron ),并证实 IL-4Rα Δneuron 小鼠的 DRG 中缺失 Il-4ra,而不是 Il-2rg 或 Il-13ra1。IL-4Rα Δneuron 小鼠的 DRG 神经元中对 IL-4 和 IL-13的反应大幅减弱。相比之下,IL-4Rα Δneuron 小鼠的DRG 神经元对其他致痒剂(包括 IL-31 和组胺)的反应正常。建立 MC903 诱导的 AD 模型发现,IL-4Rα Δneuron 小鼠的搔抓行为明显减少。耳厚度测量和组织病理学评估显示,MC903 处理 IL-4Rα Δneuron小鼠的皮肤炎症减少。因此,神经元 IL-4Rα 信号的缺失抑制慢性痒和皮肤炎症。
4. 感觉神经元 JAK1 信号介导慢性痒
在免疫细胞中,Th2 型细胞因子通过 JAK 依赖性信号转导。本研究探讨了痒觉神经元是否也表达JAK 信号转导通路。使用已发表的单细胞 RNA-seq数据库,明确了JAK1的表达在痒觉神经元中富集,而且 IL-4 刺激能诱导感觉神经元 JAK1 磷酸化水平升高。为了在功能上评估 Th2 型细胞因子是否以JAK1 依赖性方式激活感觉神经元,本研究构建了在感觉神经元中敲除 JAK1 的小鼠 (Na V 1.8-Cre + JAK1 fl/fl ,JAK1 Δneuron )。钙成像实验发现,在缺少 JAK1 的情况下,DRG 神经元对 IL-4 的反应消失。使用JAK 抑制剂 ruxolitinib 药理学抑制 JAK 信号,与JAK1 Δneuron 小鼠中的发现类似,将 ruxolitinib 作用于 DRG 神经元导致其对 IL-4 的钙反应减少。建立MC903 诱导的 AD 模型发现,JAK1 Δneuron 小鼠的搔抓行为明显减少,并且腹腔注射 ruxolitinib 也能显著减少搔抓行为。病理组织学研究显示,腹腔注射ruxolitinib 仅稍微减少炎症反应。因此,ruxolitinib的抗痒作用可能主要通过对神经元的 JAK 信号直接抑制来介导,而不是通过抑制皮肤炎症。此外,在AEW 诱导的干皮病模型(一种与明显炎症无关的慢性痒模型),JAK1 Δneuron 小鼠的搔抓行为明显减少。综之,即使在没有强烈的皮肤炎症的情况下,神经元 JAK1 仍是慢性痒的关键信号。
5. CIP 病人在没有皮肤炎症的情况下表现出严重的瘙痒
CIP 是一种未知病因的瘙痒症,不伴有明显的皮肤炎症。由于 Th1 型免疫力的缺陷,CIP 病人表现出轻微的 Th2 型免疫特征,即外周嗜酸性粒细胞增多和免疫球蛋白 E (IgE) 升高。组织病理学表明 AD存在皮肤炎症的多种特征,包括角化过度,棘皮病和混合皮肤炎性浸润。形成鲜明对比的是,CIP 的组织病理学检查中仅显示极低的炎症。值得注意的是,尽管皮肤炎症比较轻微,但 CIP 病人报告比 AD 病人更痒。因此,慢性痒既能在强烈的皮肤炎症情况下出现,也能在没有明显的炎症情况下出现。为了在分子水平表征 CIP,本研究对来自 CIP病人的皮肤、AD 病人的损伤皮肤和对照受试者的皮肤进行 RNA-seq 分析。对表达在对照和 AD 皮肤的前 100 个差异表达的基因进行的样本聚类分析,结果显示,与对照皮肤相比,CIP 皮肤与 AD 皮肤更密切相关。然而,CIP 和 AD 皮肤的基因组富集分析 (GSEA) 揭示了许多将 CIP 与 AD 区分开的特异性转录程序,AD 皮肤与免疫反应的广泛激活有关,然而 CIP 皮肤富含多种转录程序,包括细胞形态学和钙转运。综之,这些发现表明 CIP 是一种与AD 共享分子标记的慢性痒症,尽管在炎症方面与AD 有明显的差异。
6. JAK 抑制剂改善 CIP 病人的瘙痒症
研究表明,JAK抑制剂作为一种抗炎药物治疗,可以快速和显著减少 AD 病人的瘙痒症状。本研究发现阻断神经元 JAK1 信号显著缓解炎性和非炎性慢性痒。因此,尽管在 CIP 中没有明显的皮肤炎症,JAK 抑制剂也可能有效缓解 CIP 病人的瘙痒症。本研究对 5 例严重 CIP 病人使用 JAK 抑制剂 tofac-itinib 进行了非适应症型用药 (off-label)。所有病人以前都没有进行其他的非适应症型用药(包括免疫抑制治疗)。口服 tofacitinib 治疗 1 个月后,5 例CIP 病人的瘙痒症均有明显改善。与其他的免疫抑制治疗相比,随着时间的推移,服用 tofacitinib 治疗的病人,报告了瘙痒症的快速缓解。因此,使用JAK抑制剂可能作为慢性痒症病人的新治疗策略。